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Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4755 (2023) Citar este artículo

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La tecnología actual de perfusión mecánica permite conservar hígados ex situ durante períodos cortos para evaluar la viabilidad antes del trasplante. La perfusión normotérmica a largo plazo de hígados es un campo emergente con un tremendo potencial para la evaluación, recuperación y modificación de órganos. En este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar un modelo a largo plazo de perfusión ex situ que incluyera una división quirúrgica y perfusión simultánea de ambos órganos parciales. Los hígados humanos rechazados para trasplante se perfundieron utilizando un perfundido a base de glóbulos rojos en condiciones normotérmicas (36 °C) y luego se dividieron y se perfundieron simultáneamente en máquinas separadas. Se dividieron diez hígados humanos, lo que dio como resultado 20 hígados parciales. La mediana de viabilidad ex situ fue de 125 h y la mediana de supervivencia ex situ fue de 165 h. La supervivencia a largo plazo quedó demostrada mediante la eliminación de lactato, la producción de bilis, la producción de factor V y el almacenamiento de trifosfato de adenosina. Aquí, informamos la perfusión ex situ a largo plazo de hígados humanos y demostramos la capacidad de dividir y perfundir estos órganos utilizando un protocolo estandarizado.

La tecnología de perfusión con máquina normotérmica ofrece una serie de ventajas sobre las técnicas tradicionales para la conservación de órganos antes del trasplante1. La perfusión de un hígado humano donado antes del trasplante puede prolongar el tiempo de conservación ex situ a corto plazo y, al mismo tiempo, permitir cierta evaluación de la viabilidad del órgano como predictor de la función del injerto postrasplante2,3. El objetivo principal de esta tecnología hasta la fecha ha sido aumentar la utilidad de los órganos marginales mediante perfusión a corto plazo en el rango de horas. Sin embargo, la perfusión en el rango de días a semanas podría facilitar una evaluación más sofisticada de estos órganos con potencial de recuperación o modificación antes del trasplante4,5. Esto no sólo podría aumentar el número de órganos disponibles para trasplante, sino que también podría mejorar la calidad de los injertos que se utilizan actualmente.

Con este fin, se ha informado de la perfusión de hígados durante hasta 7 días utilizando un sistema integrado hecho a medida en condiciones subnormotérmicas (34 °C)4. La perfusión a esta temperatura tiene efectos metabólicos protectores pero no simula las condiciones fisiológicas reales6,7. El mismo grupo también informó sobre el trasplante exitoso y el seguimiento de 1 año de un hígado que fue perfundido mediante preservación normotérmica ex situ durante 3 días8. Nunca se ha informado sobre la perfusión a largo plazo de hígados humanos más allá de 7 días en condiciones normotérmicas (36 °C) y podría desbloquear el potencial de regeneración y modificación de órganos antes del trasplante.

La perfusión ex situ a largo plazo de hígados humanos en condiciones normotérmicas también representa una oportunidad única para estudiar tejido humano vivo ex situ. Al dividir hígados humanos completos durante la perfusión normotérmica de la máquina, como hemos descrito anteriormente9,10,11, esta tecnología se puede aplicar a dos hígados parciales. Esto podría proporcionar un entorno simulado para probar terapias con un control combinado y el estudio de la lesión y regeneración del hígado.

En este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar un modelo de prueba de concepto de perfusión ex situ normotérmica a largo plazo de hígados divididos humanos para ampliar los límites de la perfusión ex situ al extender la supervivencia más allá de 7 días y perfundir simultáneamente dos órganos parciales. De esta manera, buscamos desarrollar un modelo para investigar la perfusión hepática a largo plazo con aplicaciones potenciales en la investigación traslacional y más allá.

Se consideraron para su inclusión todos los hígados de donantes en Nueva Gales del Sur que dieron su consentimiento para la investigación y rechazaron el trasplante clínico entre febrero y diciembre de 2021. Un hígado sufrió deterioro debido a antecedentes conocidos de hipertensión portal y el segundo debido a cirrosis. Para desarrollar el protocolo, se perfundieron tres hígados enteros sin dividirlos. Utilizando nuestro protocolo, se dividieron 10 hígados humanos donados, lo que dio como resultado 10 LLSG y 10 ERG que se perfundieron en máquinas de perfusión separadas.

Para los hígados que se dividieron, cuatro de los diez hígados se obtuvieron a través de la vía de donación después de la muerte cerebral (DBD), y seis se obtuvieron a través de la vía de donación después de la determinación circulatoria de la muerte (DCD). Las razones para el descarte de hígados donados se resumen en la Tabla 1. Algunos de estos hígados pueden haber sido "trasplantables" en otros centros, pero la decisión de usarlos no estuvo influenciada por el protocolo de nuestro estudio. Las razones para no utilizar hígados DBD para trasplantes fueron: esteatosis, pruebas de función hepática gravemente alteradas, sepsis biliar conocida y un hígado con un lavado deficiente de la mesa posterior. Los hígados DCD no fueron utilizados clínicamente por edad superior a los criterios de aceptación de DCD en nuestro centro (>50 años) en 3/6, y el resto por tiempo prolongado hasta el cese de la circulación (>30 min), obesidad mórbida y Agudeza de la actividad del trasplante. La mediana del tiempo de isquemia por frío (CIT, definido como el tiempo desde la perfusión fría hasta la reperfusión utilizando la máquina ex situ) fue de 295 min (rango intercuartil [IQR] 273–430 min) (Tabla complementaria 1). Para los hígados con DCD, la mediana del tiempo hasta la muerte (retirada del soporte cardiorrespiratorio hasta el cese de la circulación) fue de 20 min (RIQ 19-29 min) (Tabla complementaria 1).

Todos los hígados completos (3/3) demostraron una rápida eliminación de lactato después del inicio de la perfusión (Figura complementaria 1A). Utilizando nuestro protocolo para perfusión a largo plazo, todos estos hígados completos sobrevivieron durante> 7 días con evidencia de eliminación de lactato y producción de bilis (Figura complementaria 1B). Una vez que el lactato comenzó a aumentar más allá de 2,5 mmol/L, observamos un deterioro irreversible en la función de los órganos que finalmente terminó en insuficiencia orgánica en todos los casos.

Todos los hígados fueron evaluados continuamente para determinar la viabilidad hepatocelular de acuerdo con los criterios propuestos por el ensayo clínico VITTAL2. Aparte de dos hígados que fallaron tempranamente debido a un error técnico en la transferencia de órganos, todos los hígados permanecieron viables hasta las 48 h de perfusión. A los 5 días de perfusión, 11/20 hígados continuaron cumpliendo los criterios de viabilidad y la mediana del tiempo de viabilidad general fue de 125 h (RIQ 88-176 h) (Fig. 1A, Tabla complementaria 2). Después de que el lactato aumentó a >2,5 mmol/L y ya no se cumplieron los criterios de viabilidad, se continuó la perfusión para todos los hígados parciales de manera exploratoria para caracterizar los cambios relacionados con la insuficiencia orgánica. El tiempo desde la inviabilidad hasta la insuficiencia orgánica completa (lactato >10 mmol/l y aumento exponencial con falta de producción de bilis o hipoglucemia que no responde) fue típicamente <48 h (16/20 injertos). La mediana de supervivencia general fue de 165 h (RIQ 113-224 h), con 9/20 hígados sobreviviendo >7 días y 4/20 hígados sobreviviendo >10 días (Fig. 1B, Tabla complementaria 2). La supervivencia global máxima fue de 327,5 h. La viabilidad hepatobiliar se evaluó utilizando criterios del ensayo DHOPE-COR-NMP12. Los mismos dos hígados que fallaron debido a un error técnico tampoco fueron viables según estos criterios, pero todos los demás hígados parciales cumplieron con estos criterios de viabilidad hepatobiliar durante hasta 48 h de perfusión (Tabla complementaria 3). En particular, todos estos hígados también produjeron bilis con un pH> 7,40, lo que indica una función de colangiocitos conservada (Tabla complementaria 3).

La viabilidad de los órganos se evaluó continuamente hasta que los hígados parciales ya no cumplían los criterios de viabilidad* (A). La perfusión continuó hasta que los órganos fallaron (B), caracterizado por un lactato >10 mmol/L con falta de producción de bilis o hipoglucemia que no responde. Todos los hígados demostraron eliminación de lactato (C), producción de bilis (D), producción de factor V (E) y evidencia de consumo de oxígeno (F) hasta el punto de insuficiencia orgánica. El pH y la glucosa del perfundido generalmente se mantuvieron estables durante la perfusión hasta la insuficiencia orgánica, lo que resultó en acidosis refractaria e hipoglucemia que no respondió (G, H). El pH de la bilis fue típicamente alcalótico y la glucosa biliar estuvo típicamente en el rango de hipoglucemia durante la perfusión (I, J). *Viabilidad según los criterios propuestos por el ensayo clínico VITTAL (≤2,5 mmol/L, y dos o más de: producción de bilis, pH ≥ 7,30, metabolismo de la glucosa, flujo arterial hepático ≥150 ml/min y flujo de la vena porta ≥500 ml /min, o perfusión homogénea)2.

Todos los hígados parciales demostraron eliminación de lactato. El lactato residual de los concentrados de glóbulos rojos utilizados para sintetizar el perfusado fue rápidamente eliminado por todo el hígado y luego por el ERG después de dividirse (el ERG se transfirió a la segunda máquina de perfusión con sangre "nueva", mientras que el LLSG permaneció conectado a la primera). máquina de perfusión). El aclaramiento de lactato continuó durante la perfusión con el mantenimiento de un nivel de lactato en perfusión típicamente <1,5 mmol/L hasta el punto de insuficiencia orgánica, donde el lactato aumentó exponencialmente (Fig. 1C). Los niveles de bilirrubina, GGT y ALP en la perfusión permanecieron bajos, pero aumentaron gradualmente durante la perfusión hasta el punto de insuficiencia orgánica (Figura 2 complementaria). Los niveles de perfusión de ALT alcanzaron su punto máximo en las primeras 48 a 72 h después de la reperfusión hepática completa antes de estabilizarse y luego disminuir durante la perfusión a largo plazo (Figura 2 complementaria).

La producción de bilis fue constante durante la perfusión tanto en el hígado izquierdo como en el derecho, con tasas de producción comparables después del ajuste al peso de cada hígado parcial. La producción generalmente se desaceleró y cesó en correspondencia con la insuficiencia orgánica (Fig. 1D). El pH de la bilis normalmente se mantuvo en un rango alcalótico durante la perfusión (Fig. 1I). De manera similar, el tiempo de protrombina (PT) de la perfusión y los niveles de Factor-V se mantuvieron durante la perfusión en todos los hígados parciales hasta la insuficiencia orgánica, y hubo evidencia de consumo de oxígeno en todos los hígados a largo plazo (Fig. 1E, F, Fig. Suplementaria). .2D). El pH del perfundido fue típicamente estable entre 7,2 y 7,5 durante la perfusión, con una acidosis refractaria característica que se correspondía con las etapas finales de la insuficiencia orgánica (Fig. 1G). Los niveles de perfusión de albúmina, urea y proteína total se mantuvieron durante toda la perfusión sin cambios notables en caso de insuficiencia orgánica (Figura complementaria 2).

El nivel de glucosa en la perfusión fue típicamente alto en las primeras 48 a 72 h de perfusión y posteriormente se mantuvo en el rango de 10 a 20 mmol/l durante la perfusión a largo plazo (Fig. 1H). El final de la perfusión se caracterizó por hipoglucemia refractaria correspondiente a insuficiencia orgánica.

Utilizamos un sistema controlado por presión que permitió el control independiente de la presión arterial hepática y venosa portal con medición del flujo vascular. En el ERG, la canulación de la arteria hepática derecha típicamente logró flujos de 200 ml/min, y en el LLSG, la canulación del tronco celíaco típicamente también logró flujos de 200 ml/min (Fig. 2A, B). Después del ajuste por peso del hígado, el LLSG logró flujos/min/kg de hígado significativamente mayores que el ERG (mediana 316 ml/min [RIC 224-613 ml/min] frente a 126 ml/min [RIC 72-209 ml/min] , p = 0,003, a las 4 h después de la división) (Fig. 2C). Para el ERG, la canulación de la vena porta principal generalmente logró flujos de 1,0 l/min, mientras que en el LLSG, la canulación de la vena porta izquierda logró solo 300 a 400 ml/min (Fig. 2D, E). El ajuste por peso del hígado demostró que este caudal era similar entre ERG y LLSG (Fig. 2F). Las presiones y los flujos vasculares generalmente permanecieron estables durante la perfusión sin suplementos vasodilatadores. La insuficiencia orgánica se caracterizó por un fuerte aumento de la resistencia de la arteria hepática inmediatamente antes de que se terminara la perfusión.

Utilizando un sistema controlado por presión con un objetivo de 60 mmHg para la arteria hepática, el ERG y el LLSG normalmente alcanzaron 200 ml/min de flujo sanguíneo (A, B). Después del ajuste por peso del hígado, el LLSG logró flujos/min/kg de hígado significativamente mayores que el ERG (mediana 316 ml/min [RIC 224-613 ml/min] frente a 126 ml/min [RIC 72-209 ml/min] , p = 0,003, 4 h después de la división, prueba U de Mann-Whitney) (C) (n = 20 hígados parciales; 10 ERG, 10 LLSG, expresados como mediana (IQR)). Con un objetivo de 8 mmHg para la vena porta, el ERG y el LLSG normalmente alcanzaron 1,0 l/min y 300 a 400 ml/min, respectivamente (D, E). Después del ajuste por peso del hígado, el flujo de la vena porta fue similar entre ERG y LLSG (F) (n = 20 hígados parciales; 10 ERG, 10 LLSG, expresados como mediana (IQR)). Los niveles de ATP y glucógeno en el tejido hepático permanecieron estables o aumentaron durante la perfusión tanto en ERG como en LLSG en comparación con el valor inicial (G, H). ATP trifosfato de adenosina, injerto derecho extendido ERG, injerto de segmento lateral izquierdo LLSG, *p < 0,05.

Las biopsias centrales del hígado tomadas durante la perfusión mostraron evidencia de almacenamiento de energía durante la perfusión a largo plazo. Los niveles de trifosfato de adenosina (ATP) y glucógeno en el tejido hepático permanecieron estables o aumentaron durante la perfusión tanto en LLSG como en ERG en comparación con el valor inicial (Fig. 2G, H).

La arquitectura hepática se conservó a largo plazo tanto para los LLSG como para los ERG con bajas tasas de necrosis coagulativa o desprendimiento de hepatocitos durante la perfusión (Fig. 3). En las etapas finales de la insuficiencia orgánica se observó una evidencia cada vez mayor de lesión hepática y distorsión arquitectónica (Fig. 3). El agotamiento de glucógeno disminuyó durante la perfusión, lo que demuestra una mayor deposición de glucógeno intracelular dentro de los hepatocitos a largo plazo (Fig. 3B). Se observó evidencia de proliferación celular, con hepatocitos teñidos positivamente para ki67 antes y después de la división. Sin embargo, la cantidad de proliferación celular disminuyó hacia el final de la perfusión (Fig. 3C, D). Se presentó lesión biliar en las biopsias del conducto biliar con evidencia de necrosis estromal mural; sin embargo, el 80% de los hígados demostró epitelio biliar intacto, lo que sugiere integridad del árbol biliar preservada (Figura complementaria 3).

Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina para evaluar la integridad arquitectónica (A), ácido periódico de Schiff para el agotamiento de glucógeno (B) y ki67 para la proliferación celular (C, D). La cantidad de proliferación celular disminuyó desde el principio de la perfusión (C) hasta el final de la perfusión (D). La evaluación de cada portaobjetos fue realizada por un patólogo especialista ciego para detectar necrosis coagulativa (E), desprendimiento de hepatocitos (F) y agotamiento de glucógeno (G)22. Los niveles de necrosis coagulativa y desprendimiento de hepatocitos se mantuvieron bajos hasta el punto de insuficiencia orgánica (E, F). La deposición de glucógeno dentro de los hepatocitos aumentó con la perfusión a largo plazo (G).

Al agrupar aquellos hígados parciales que sobrevivieron >7 días o ≤7 días, examinamos los factores que predijeron la supervivencia a largo plazo. En total, 9/20 hígados parciales sobrevivieron >7 días. Esto incluyó 4 LLSG y 5 ERG, y estos hígados parciales se derivaron de seis hígados completos diferentes. Las características de los donantes no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos. La edad media de los donantes de hígados que sobrevivieron >7 días y ≤7 días fue 52,8 ± 13,3 y 53,6 ± 15,4 (p = 0,908), respectivamente. Los donantes de todos los órganos fueron más comúnmente hombres (7/9 para hígados que sobrevivieron >7 días y 7/11 para hígados que sobrevivieron ≤7 días) y se recuperaron con mayor frecuencia a través de la vía DCD (6/9 frente a 6/11 respectivamente) (Tabla complementaria 4).

Los niveles de perfusión de lactato y perfusión de transaminasas (bilirrubina, alanina aminotransferasa [ALT], fosfatasa alcalina [ALP], gamma-glutamil transferasa [GGT]) no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos (Fig. 4A, Fig. Suplementaria 4). La tasa de producción de bilis ajustada por peso fue significativamente mayor en los hígados que sobrevivieron >7 días a las 24 h, 60 h y 72 h después de la división (mediana 3,674 ml/h/kg de hígado [RIC 2,247–4,576 ml/h/kg de hígado). ] vs 1,714 ml/h/kg de hígado [RIQ 0,478-2,516 ml/h/kg de hígado], p = 0,008 a las 24 h) (Fig. 4B). El nivel de perfusión de Factor-V fue significativamente mayor en los hígados que sobrevivieron >7 días inmediatamente antes de la división y en cada momento hasta 72 h después de la división (media 47,3 ± 19,9 % frente a 15,4 ± 12,7 %, p < 0,001 a las 24 h ) (Figura 4C). El PT del perfundido fue significativamente más corto en los hígados que sobrevivieron> 7 días inmediatamente antes de la división y 4 h después de la división (Fig. 4D). La urea perfundida, la albúmina, las proteínas totales, el pH de la bilis y la glucosa biliar no demostraron diferencias significativas entre los dos grupos (Fig. 4, Fig. 4 complementaria).

Los niveles de lactato perfundido no fueron significativamente diferentes entre los hígados que sobrevivieron >7 días o ≤7 días (A). La producción de bilis y los niveles de factor V fueron significativamente mayores en los hígados que sobrevivieron >7 días (bilis: mediana 3,674 ml/h/kg de hígado [RIC 2,247–4,576 ml/h/kg de hígado] frente a 1,714 ml/h/kg de hígado [ IQR 0,478–2,516 ml/h/kg hígado], p = 0,008 a las 24 h, prueba U de Mann-Whitney; Factor-V: media 47,3 ± 19,9% vs 15,4 ± 12,7%, p < 0,001 a las 24 h, dos- prueba t lateral) (B, C). El tiempo de protrombina fue significativamente más corto en los hígados que sobrevivieron >7 días inmediatamente antes y 4 h después de la división (mediana 54 s [RIC 38–48 s] frente a 150 s [RIC 55–91 s] a las 4 h, p = 0,015, Mann– Prueba U de Whitney) (D). El consumo de oxígeno, la perfusión de urea, el pH de la bilis y la glucosa en la bilis no demostraron diferencias significativas entre los dos grupos (E – H). El flujo de la arteria hepática fue significativamente mayor en los hígados que sobrevivieron >7 días para la misma presión de la arteria hepática (mediana 615 ml/min [RIC 530-674 ml/min] frente a 342 ml/min [RIC 308-405 ml/min], p = 0,002, justo antes de dividir, prueba U de Mann-Whitney) (I, J). La presión venosa portal no fue significativamente diferente entre los dos grupos (K). El flujo venoso portal fue significativamente mayor en los hígados que sobrevivieron >7 días entre los días 1 a 3 después de la división (mediana 1,030 ml/min [RIC 0,320–1,310 ml/min] frente a 0,280 ml/min [RIC 0,220–0,970 ml/min] , p = 0,049, 1 día después de la división, prueba U de Mann-Whitney) (L). Todos los datos agrupados se presentan como mediana (RIQ) excepto el Factor-V, que se distribuyó normalmente y se presentó como media (desviación estándar), n = 20 hígados parciales, 9 sobrevivieron >7 días, 11 sobrevivieron ≤7 días. Los datos distribuidos normalmente y los datos distribuidos no normalmente se compararon en cada momento agrupado utilizando una prueba t bilateral no apareada y una prueba U de Mann-Whitney, respectivamente. *p < 0,05.

El flujo de la arteria hepática fue significativamente mayor en aquellos hígados que sobrevivieron >7 días antes y después de la división (mediana 615 ml/min [RIC 530-674 ml/min] frente a 342 ml/min [RIC 308-405 ml/min], p = 0,002, justo antes de dividir) (Fig. 4J). Esta diferencia fue evidente al utilizar objetivos de control de presión que solo se modificaron para cumplir con los requisitos mínimos de flujo. Después de ajustar por el peso de cada hígado, esta diferencia todavía estaba presente pero era menos pronunciada (Figura complementaria 4). Los flujos venosos portales fueron significativamente mayores para los hígados que sobrevivieron >7 días entre los días 1 y 3 después de la división (mediana 1,030 ml/min [RIC 0,320–1,310 ml/min] frente a 0,280 ml/min [RIC 0,220–0,970 ml/min] , p = 0,049, 1 día después de la división) (Fig. 4L).

La gravedad de la esteatosis microvesicular observada en biopsias centrales tomadas antes de la división fue significativamente menor en los hígados que sobrevivieron >7 días (mediana 5 % [RIC 0–7,5 %] frente a 20 % [RIQ 5–35 %], p = 0,041 a las 0 h ) (Figura 5A). Sin embargo, la gravedad de la esteatosis macrovesicular, la necrosis coagulativa y el desprendimiento de hepatocitos no fue significativamente diferente entre los dos grupos (Figs. 3E, F y 5B).

Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina y un patólogo especialista ciego los evaluó para detectar esteatosis microvesicular (A) y macrovesicular (B). La esteatosis microvesicular observada en biopsias centrales tomadas antes de la división fue significativamente menos grave en hígados que sobrevivieron >7 días (mediana 5 % [RIC 0–7,5 %] frente a 20 % [RIQ 5–35 %], p = 0,041 a las 0 h, Mann –Prueba U de Whitney) (A). Todos los datos agrupados se presentan como mediana (IQR), n = 20 hígados parciales, 9 sobrevivieron >7 días, 11 sobrevivieron ≤7 días, *p < 0,05.

Este es el primer estudio que demuestra un modelo funcional de perfusión mecánica normotérmica a largo plazo de hígados divididos humanos. Utilizando hígados que no eran utilizables en nuestro centro para trasplante, se logró la conservación ex situ durante más de 7 días y hasta un máximo de 13 días. Esta no solo es la preservación ex situ de hígados humanos más larga jamás reportada, sino que también informamos la perfusión de dos órganos parciales del mismo hígado completo. La perfusión en el rango de días a semanas puede facilitar una evaluación más sofisticada de la viabilidad, la reparación de órganos antes del trasplante e incluso la regeneración1,4,5. Por lo tanto, este modelo tiene un enorme potencial para estudiar terapias con un control ideal y como modelo para la investigación traslacional. Aunque elegimos realizar una división tradicional para dividir el hígado en un LLSG y un ERG para este estudio, nuestro protocolo podría adaptarse fácilmente a la división completa izquierda-derecha para proporcionar dos hígados parciales con una coincidencia aún más estrecha.

Además, esto se ha logrado mediante la modificación de un sistema de perfusión hepática disponible comercialmente con componentes fácilmente disponibles (oxigenadores de larga duración, mezclador de gases, filtro de diálisis). Esto tiene la ventaja de ser fácilmente reproducible y accesible para otros centros interesados en la perfusión a largo plazo de hígados totales o parciales y abre el camino para la colaboración global e innumerables posibilidades como modelo para la investigación traslacional.

Esta es también la primera descripción de la perfusión a largo plazo de un injerto de tamaño pediátrico (LLSG). Esto tiene sus propios desafíos relacionados con la torsión de los vasos, el mantenimiento de un entorno fisiológico con un flujo vascular y un volumen sanguíneo artificialmente altos y la titulación de los requisitos nutricionales. De hecho, los flujos arteriales altos y portovenosos bajos en relación con el ERG se debieron muy probablemente al uso del tronco celíaco grande y la vena porta izquierda pequeña para la canulación del LLSG. Sin embargo, 4/9 hígados parciales que sobrevivieron >7 días fueron LLSG. La revolución de la perfusión mecánica aún no se ha realizado en el campo de la pediatría13, quizás debido a desafíos técnicos. Aún así, las adaptaciones y modificaciones logradas en este estudio allanan el camino para estos avances.

Otros desafíos al utilizar este protocolo incluyeron la intensidad requerida para el ajuste manual de las infusiones y la configuración de diálisis. El sistema comercial modificado utilizado en este estudio siempre requirió una estrecha supervisión y un ajuste algorítmico de los parámetros (Figura complementaria 5). Esto podría mejorarse en el futuro mediante el control digital y la automatización de la máquina mediante un diseño personalizado y la integración de múltiples sistemas.

La perfusión hepática a largo plazo aún no se ha estudiado en gran medida. Un grupo suizo perfundió con éxito hígados completos e hígados parciales después de una hepatectomía utilizando una máquina de perfusión integrada hecha a medida4,14. Utilizando automatización integrada y temperaturas subnormotérmicas a 34 °C6, se lograron 7 días de perfusión. Por el contrario, utilizamos condiciones normotérmicas reales (36 °C), lo que permite una simulación precisa de las condiciones fisiológicas y una evaluación sin compromiso metabólico. La perfusión de hígados partidos como modelo para la investigación también está infrautilizada. Hasta ahora, la perfusión más larga de hígados parciales compatibles fue de 6 h utilizando un portador de oxígeno artificial y una división ex situ tradicional15. Nuestro modelo podría, en el futuro, adaptarse al trasplante clínico con la ventaja de un tiempo de isquemia fría más corto con una división que se produce sin interrupción del flujo vascular y una perfusión continua de ambos hígados a largo plazo, lo que permite un tiempo adecuado para una evaluación más sofisticada.

La perfusión a largo plazo nos ha brindado una mejor comprensión de los cambios que ocurren durante la perfusión ex situ de la máquina en condiciones normotérmicas. A pesar de los suplementos nutricionales y hormonales y de la filtración de la sangre mediante diálisis, todos los hígados de este estudio finalmente fallaron. Esto sugiere que hay un período de “Ricitos de Oro” dentro del cual estos hígados están en su mejor momento. Durante este período, el hígado ha sido perfundido el tiempo suficiente para permitir una reanimación y reparación adecuadas, así como una evaluación de la viabilidad, pero no demasiado tiempo como para que la calidad del hígado disminuya y haya comenzado el deterioro irreversible hacia la insuficiencia orgánica. La utilización de los criterios de viabilidad propuestos por el ensayo clínico VITTAL en este estudio nos permitió identificar el punto probable de no retorno (normalmente alrededor de cinco días). También se debe tener en cuenta la viabilidad biliar, que se espera que sea independiente de la viabilidad hepatocelular16. Por ello, se requieren criterios más sofisticados y menos subjetivos3.

Con este fin, al agrupar hígados que sobrevivieron >7 días y ≤7 días en este estudio, pudimos identificar predictores de supervivencia a largo plazo utilizando bioquímica hepática, marcadores de función hepática sintéticos, hemodinámica hepática e histopatología. Los órganos que sobrevivieron más de 7 días tuvieron tasas significativamente más altas de producción de bilis, niveles más altos de factor V, flujos de arteria hepática más altos y cantidades más bajas de esteatosis microvesicular. Estos cambios fueron notables dentro de las primeras 48 a 72 h de perfusión y representaron objetivos potenciales para definir una firma para la supervivencia a largo plazo. Esto no sólo tiene implicaciones para la evaluación de la calidad inherente de los órganos, sino que esta firma puede reevaluarse en tiempo real y guiarnos en la reanimación y recuperación de estos hígados a largo plazo.

La evaluación de la viabilidad y la supervivencia a largo plazo de los órganos en este estudio está limitada por la falta de validación mediante trasplante. Desafortunadamente, los hígados disponibles para la investigación en este estudio se consideraron inadecuados para el trasplante y, por lo tanto, la evaluación mediante trasplante no fue posible en este entorno. Sin embargo, esto nos brindó la oportunidad de estudiar estos hígados hasta su falla, lo que ha proporcionado información valiosa sobre los patrones metabólicos y hemodinámicos que ocurren hacia la muerte del órgano. Es importante destacar que lograr estos resultados utilizando órganos marginales sugiere que cuando aplicamos esto a órganos ideales que son adecuados para trasplante, es probable que podamos lograr resultados de supervivencia más confiables e incluso más prolongados. Este estudio también se centró principalmente en la viabilidad de los órganos desde la perspectiva de la función hepatocelular. El trabajo futuro debería realizar un estudio más detallado de la función colangiocelular y la evaluación de la viabilidad biliar a largo plazo.

Finalmente, comprender por qué todos estos órganos eventualmente fallan es un área de investigación en curso para nuestro grupo. Hacia la insuficiencia orgánica, hemos observado un patrón característico que implica un rápido aumento del lactato, un aumento de la resistencia vascular hepática con flujos arteriales y portovenosos hepáticos bajos, acidosis refractaria del perfundido e hipoglucemia que no responde. La insuficiencia orgánica puede ser secundaria a la falta de un componente metabólico clave necesario para el mantenimiento de la homeostasis energética o a un deterioro de la calidad del perfundido con el tiempo, ya que los productos sanguíneos no se rellenaron ni renovaron17. Este modelo también sigue siendo no fisiológico sin un eje intestino-hígado o una variación circadiana automatizada18. Estas razones pueden explicar por qué la mayoría de los hígados inevitablemente comenzaron a fallar después de 5 a 7 días de perfusión. Alternativamente, puede faltar un estímulo del factor de crecimiento que indique a los hepatocitos que se regeneren1. El trabajo futuro debería apuntar a comprender por qué fallan estos órganos, desbloquear el potencial para preservarlos durante semanas o meses y brindar más tiempo para una intervención y regeneración significativas.

La capacidad de perfundir hígados humanos divididos en condiciones normotérmicas a largo plazo tiene un enorme potencial. En este estudio, describimos un modelo funcional que utiliza un sistema de perfusión hepática modificado disponible comercialmente para perfundir hígados humanos divididos durante> 7 días. Este modelo representa la perfusión más larga jamás realizada de hígados humanos ex situ en condiciones normotérmicas y ha proporcionado nueva información sobre cómo se pueden evaluar estos órganos para uso clínico y por qué fallan a largo plazo. Describimos un modelo adecuado para la perfusión ex situ de órganos de tamaño pediátrico y para ampliar las aplicaciones de la tecnología de perfusión ex situ. Además, esta técnica tiene un enorme potencial en la prueba de terapias y allana el camino para la colaboración en los campos de los trasplantes, las ciencias básicas y más.

Los hígados de donantes humanos fallecidos que fueron rechazados para trasplante fueron aceptados para investigación de acuerdo con un protocolo ético aprobado por el Comité de Revisión de Ética del Distrito de Salud Local de Sydney (X18-0523 y 2019/ETH08964). El consentimiento para la investigación se obtuvo en el momento del consentimiento para la donación de órganos por parte de la organización de donación centralizada de Australia, DonateLife. Consideramos hígados DBD y DCD y solo rechazamos un órgano cuando había evidencia clínica o bioquímica de cirrosis. Todos los hígados se obtuvieron utilizando nuestra técnica estándar con lavado aórtico usando Soltran frío (Baxter Healthcare, Illinois, EE. UU.) y solución de preservación de la Universidad de Wisconsin (Belzer UW, Bridge to Life, Columbia, EE. UU.), seguido de almacenamiento en frío estático para transferirlo a nuestro centro. No se utilizaron órganos de prisioneros ejecutados.

Modificamos un sistema de perfusión hepática comercial (Liver Assist, Xvivo, Groningen, Países Bajos) como se describió anteriormente utilizando equipos disponibles comercialmente9,10,11. Este sistema utiliza una configuración de bomba dual con un depósito venoso abierto y una unidad termorreguladora. Las modificaciones se resumen en la Fig. 6. Reemplazamos los oxigenadores proporcionados comercialmente por oxigenadores de largo plazo (Quadrox-iD Pediatric, Macquet, Getinge Group, Rastatt, Alemania) y agregamos un mezclador de gases (Low Flow 2003 Series, Bio-Med Devices, Connecticut, EE. UU.) y reguladores de flujo pediátricos para mezclar con precisión aire comprimido con oxígeno. También conectamos un filtro de diálisis en paralelo con controles de entrada y salida ajustables (Prismaflex o Polyflux, Baxter Healthcare, Illinois, EE. UU.).

Un sistema de perfusión de órganos disponible comercialmente (Liver Assist, Xvivo, Groningen, Países Bajos) que utiliza un sistema de bomba dual (P) y un reservorio venoso abierto se modificó para una perfusión a largo plazo agregando oxigenadores a largo plazo (A), un gas. licuadora (B) y un filtro de diálisis (C).

Se preparó un perfundido a base de glóbulos rojos utilizando 4 unidades de concentrados de glóbulos rojos donados, 2 unidades de plasma fresco congelado donado, 200 ml de albúmina al 20 % y 1 litro de solución salina normal. El sistema se anticoaguló utilizando enoxaparina (100 mg dos veces al día, Clexane, Sanofi-Aventis, Auckland, Nueva Zelanda), y el perfundido se “limpió” antes de conectar el hígado mediante la circulación continua del perfundido a través del filtro de diálisis y la corrección de las anomalías electrolíticas. . Una vez que se alcanzaron las condiciones fisiológicas, los hígados humanos donados se lavaron con solución salina normal antes de la perfusión inmediata mediante cánulas de la vena porta y la arteria hepática. Utilizando un sistema controlado por presión, se eligieron objetivos de 60 mmHg y 8 mmHg para la arteria hepática y la vena porta, respectivamente. Se utilizó una cánula arterial de 18-20 F (Organ Assist, Groningen, Países Bajos) para la arteria hepática y una cánula de vena porta de 25 F (Organ Assist, Groningen, Países Bajos) para la vena porta. El objetivo era lograr un flujo de la arteria hepática de >400 ml/min y un flujo de la vena porta de >1,2 l/min. Se realizó un recalentamiento controlado con un aumento de 1° en la temperatura por hora durante 4 h (de los 32 °C iniciales a 36 °C) para mantener la perfusión en un rango de temperatura propicio para la supervivencia de los glóbulos rojos y minimizar los efectos de la lesión por isquemia-reperfusión12. 19.

Se proporcionó profilaxis antibiótica con cefazolina (1 g diario, AFP Pharmaceuticals, NSW, AUS) para minimizar la contaminación bacteriana. Se agregaron ácido taurocólico (7,7 mg/h, Cayman Chemical Company, Michigan, EE. UU.) y metilprednisolona (Solu-Medrol reconstituida a 10 mg/ml, 21 mg/h, Pfizer, NSW, AUS) para promover la supervivencia. El soporte nutricional se proporcionó mediante infusiones continuas de aminoácidos (Synthamin 17, Baxter Healthcare, Illinois, EE. UU.) y lípidos (Clinoleic 20%, Baxter Healthcare, Illinois, EE. UU.). Se administraron una vez al día un multivitamínico (Cernevit, 1 vial, Baxter Healthcare, Illinois, EE. UU.) y tiamina (clorhidrato de tiamina, 100 mg/ml, 1 vial, Biological Therapies, VIC, AUS). Se midieron el lactato, el pH, la glucosa, la pO2 y la pCO2 utilizando un analizador de gases en sangre para facilitar la modificación de las infusiones en tiempo real (RAPIDPoint 500, Siemens Healthengineers, Norwood, Massachusetts, EE. UU.). Los niveles de glucosa se mantuvieron manualmente en el rango de 5 a 15 mmol/L mediante infusiones titulables de insulina (Actrapid 100 UI/ml diluido a 2 UI/ml, rango típico: 2 a 6 UI/h, Novo Nordisk, Auckland, Nueva Zelanda), glucagón (GlucaGen reconstituido a 1 mg/ml y diluido a 20 μg/mL, rango típico: 40–120 μg/h, Novo Nordisk, Auckland, Nueva Zelanda) y glucosa (10 %, rango típico 5–20 ml/h, Baxter Healthcare , Illinois, EE.UU.). El equilibrio ácido-base y la oxigenación se mantuvieron manualmente mediante el ajuste de las proporciones de oxígeno-aire comprimido y la regulación del flujo de gas, con el objetivo de alcanzar un pH de 7,3 a 7,45 y una pO2 de 100 a 200 mmHg. La filtración de diálisis utilizando dializado sin suplementos (Hemosol B0, Baxter Healthcare, Illinois, EE. UU.) se ajustó manualmente para mantener el potasio en el rango de 3 a 5 mmol/L y la hemoglobina en el rango de 55 a 65 g/L. Todos los ajustes manuales fueron protocolizados y algorítmicos cuando fue posible (Figura complementaria 5). No se requirieron recargas de glóbulos rojos. Acidosis grave (normalmente al inicio o al final de la perfusión se trataba con alícuotas de 10 ml de bicarbonato de sodio al 8,4% (8,4 g en 100 ml, Phebra, NSW, AUS). Vasoespasmo arterial (relacionado con la manipulación del hígado o la administración de medicamentos). ) fue tratado con bolos de 2,5 mg de verapamilo (Isoptin, 5 mg/2 ml, Viatris, NSW, AUS).

Para los hígados que se dividieron, la división se realizó el día después del inicio de la perfusión, lo que correspondió a entre 12 y 16 h de perfusión hepática completa. El hígado se dividió ex situ con doble perfusión continua utilizando la técnica que hemos descrito previamente9,10,11. En resumen, el hígado se dividió en un injerto de segmento lateral izquierdo (LLSG, segmentos 2 y 3) y un injerto derecho extendido (ERG, segmentos 1 y 4-8). El tronco celíaco se asignó al LLSG y la vena porta principal se mantuvo con el ERG. Se utilizó un catéter de Foley de 10-12 F para canular la arteria hepática derecha (para el ERG) y un catéter de Foley de 18 F para canular la vena porta izquierda (para el LLSG). Se canularon el conducto biliar común (con el ERG) y el conducto hepático izquierdo (con el LLSG) para la recolección de bilis.

Después de completar la disección parenquimatosa y vascular, el ERG se transfirió a un segundo sistema de perfusión hepática modificado. El soporte nutricional se ajustó al tamaño de los órganos. En cuanto a todo el hígado, los objetivos de presión controlada se establecieron en 60 mmHg y 8 mmHg para la arteria hepática y la vena porta, respectivamente. Esto se ajustó manualmente para lograr flujos arteriales mínimos de 150 ml/min y flujos portovenosos de 300 ml/min para el LLSG y flujos arteriales de 150 ml/min y flujos portovenosos de 800 ml/min para el ERG.

Todos los hígados fueron evaluados continuamente utilizando los criterios de viabilidad propuestos en el ensayo clínico VITTAL (lactato ≤2,5 mmol/L, y dos o más de: producción de bilis, pH ≥ 7,30, metabolismo de la glucosa, flujo arterial hepático ≥150 ml/min y vena porta. flujo ≥500 ml/min, o perfusión homogénea)2. La perfusión continuó hasta que los órganos fueron claramente inviables, con un enfoque exploratorio en la comprensión de los cambios fisiológicos que conducen a la muerte del órgano. La perfusión se detuvo cuando el lactato perfundido fue >10 mmol/l o aumentó exponencialmente, y hubo un cese de la producción de bilis y una hipoglucemia que no respondía. La viabilidad hepática según el ensayo DHOPE-COR-NMP (lactato <1,7 mmol/L, pH 7,35–7,45, producción de bilis >10 ml y pH de la bilis >7,45) también se evaluó durante la perfusión para incluir una evaluación de la viabilidad biliar12. Nuestro protocolo de perfusión a largo plazo para hígados humanos divididos se resume en la Fig. 7.

Los hígados humanos donados se reaniman en condiciones normotérmicas durante 12 a 24 h antes de realizar una división convencional. Luego, el injerto del segmento lateral izquierdo y el injerto derecho extendido se perfunden en máquinas de perfusión separadas para la evaluación a largo plazo de la función hepática mediante pruebas funcionales, evaluación hemodinámica e histopatología.

Se recogieron diariamente muestras de perfusión y biopsias centrales del hígado para evaluar los marcadores bioquímicos y los cambios a lo largo del tiempo. Todas las pruebas, a menos que se especifique lo contrario, fueron medidas por el laboratorio clínico del Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, Australia. Se evaluaron pruebas de función hepática (bilirrubina, ALT, GGT, ALP) en busca de evidencia de lesión hepática a lo largo del tiempo. La función sintética del hígado se evaluó mediante perfusión de lactato, PT y niveles de Factor-V. La producción de bilis se midió cada 4 a 6 h y se ajustó al peso de cada hígado parcial para expresarlo como ml/h/kg. El pH y la glucosa del perfundido y la bilis se evaluaron utilizando un analizador de gases en sangre (RAPIDPoint 500, Siemens Healthengineers, Norwood, Massachusetts, EE. UU.).

El consumo de oxígeno se estimó utilizando la Ley de Henry, con cálculos individuales del contenido de oxígeno libre y ligado en la arteria hepática, la vena porta y la vena hepática: \([{O}_{2}=p{O}_{2}\times k +s{O}_{2}\times {Hb}\times c]\) donde pO2 y sO2 son la presión parcial de oxígeno y las saturaciones de oxígeno, respectivamente, y k es el coeficiente de solubilidad del oxígeno, y c es el coeficiente de solubilidad del oxígeno. capacidad de carga de la hemoglobina. Esto se utilizó para calcular la tasa general de extracción/consumo de oxígeno utilizando el flujo de la arteria hepática, la vena porta y la vena hepática y se ajustó al peso de los hígados: 20,21

El contenido de ATP y glucógeno del tejido hepático se determinó utilizando el kit bioluminiscente de ATP (FLAA Sigma-Aldrich) y el kit de ensayo de glucógeno (MAK016, Sigma-Aldrich), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Notas complementarias 1).

Las biopsias se fijaron en formalina, se incluyeron en parafina, se seccionaron a 4 μm y se tiñeron con tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) y ácido periódico de Schiff (PAS). La evaluación histológica fue realizada por un patólogo especialista ciego con experiencia en trasplante de hígado y enfermedades hepáticas, y cualquier consulta se resolvió consultando a un segundo patólogo especialista. Cada portaobjetos se evaluó y calificó en busca de esteatosis macrovesicular y microvesicular, necrosis coagulativa, desprendimiento de hepatocitos y agotamiento de glucógeno utilizando un sistema de puntuación cuantitativa estructurado22. Se realizó inmunohistoquímica Ki67 en portaobjetos seleccionados para evaluar la evidencia de proliferación celular. Se examinaron biopsias de conductos biliares en busca de necrosis estromal mural y lesión del epitelio biliar.

Se crearon gráficos y se realizaron análisis estadísticos utilizando GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, California, EE. UU.). Los datos de cada hígado parcial se agruparon según el tiempo después de la división y se expresaron como media ± desviación estándar o mediana (RIC), según correspondiera. Las variables continuas se compararon en cada momento agrupado mediante una prueba t bilateral no pareada o una prueba U de Mann-Whitney, según correspondiera. Los resultados se consideraron significativos si p < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos necesarios para reproducir este estudio se pueden encontrar en el manuscrito, las figuras y la información complementaria. Los datos de origen para las tablas y figuras de este estudio se proporcionan con este documento en el Archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos el apoyo y la asistencia brindados por M. Xiang, N. Koutalistras y L. Gao. También nos gustaría agradecer a DonateLife y a todos los donantes de órganos y sus familias por su apoyo, sin el cual esta investigación no sería posible. El apoyo financiero fue proporcionado por el Instituto de Trasplantes del Hospital Royal Prince Alfred. Parte del equipo utilizado en este estudio fue proporcionado por Johnson and Johnson (Harmonic Scalpel, Eschelon Stapler). NL cuenta con el apoyo de la beca de estipendio del programa de formación en investigación del gobierno australiano. ML cuenta con el apoyo del Premio de Postgrado de la Universidad de Sydney. MC-C. cuenta con el apoyo de la Beca de Investigación de Carrera Temprana y Media de NSW Health.

Centro para la optimización y reparación de la evaluación de órganos, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, Nueva Gales del Sur, 2050, Australia

Ngee-Soon Lau, Mark Ly, Andrew Jacques, Shamus Toomath, Joanna Huang, Nicole Mestrovic, Paul Yousif, Sumon Chanda, Chuanmin Wang, Geoffrey McCaughan, Michael Crawford y Carlo Pulitano

Unidad Nacional Australiana de Trasplante de Hígado, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, Nueva Gales del Sur, 2050, Australia

Ngee-Soon Lau, Mark Ly, Andrew Jacques, Shamus Toomath, Joanna Huang, Nicole Mestrovic, Paul Yousif, Sumon Chanda, Chuanmin Wang, Ken Liu, Geoffrey McCaughan, Michael Crawford y Carlo Pulitano

Facultad de Medicina y Salud, Universidad de Sydney, Sydney, Nueva Gales del Sur, 2006, Australia

Ngee-Soon Lau, Mark Ly, Andrew Jacques, Joanna Huang, Nicole Mestrovic, Chuanmin Wang, Ken Liu, James G. Kench, Geoffrey McCaughan, Michael Crawford y Carlo Pulitano

Departamento de Patología Tisular y Oncología Diagnóstica, Patología de la Salud de Nueva Gales del Sur, Hospital Royal Prince Alfred, Sydney, Nueva Gales del Sur, 2006, Australia

Claude Dennis y James G. Kench

Unidad de Investigación de Vectorología Traslacional, Instituto de Investigación Médica Infantil, Universidad de Sydney, Westmead, Sydney, Nueva Gales del Sur, 2145, Australia

Marti Cabanes-Creus & Leszek Lisowski

Instituto Militar de Medicina, Laboratorio de Oncología Molecular y Terapias Innovadoras, 04-141, Varsovia, Polonia

Leszek Lisowski

Centro Australiano de Terapéutica del Genoma, Instituto de Investigación Médica Infantil y Red de Hospitales Infantiles de Sídney, Westmead, NSW, 2145, Australia

Leszek Lisowski

Instituto Centenario, Sydney, Nueva Gales del Sur, Australia

Geoffrey McCaughan

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NL participó en el diseño de la investigación, realizó la investigación, analizó los datos y redactó el artículo. ML, CD realizó la investigación, analizó los datos y revisó el manuscrito. AJ, MC-C., ST, JH, NM, PY, SC, CW realizaron la investigación y revisaron el manuscrito. LL, KL, JK, GM y MC participaron en el diseño de la investigación y revisaron críticamente el manuscrito. CP participó en el diseño de la investigación, realizó la investigación, analizó los datos y revisó el manuscrito.

Correspondencia a Carlo Pulitano.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Robert Porte, Guillaume Rossignol y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Lau, NS., Ly, M., Dennis, C. et al. Perfusión normotérmica ex situ a largo plazo de hígados humanos divididos durante más de 1 semana. Nat Comuna 14, 4755 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40154-8

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Recibido: 21 de febrero de 2023

Aceptado: 14 de julio de 2023

Publicado: 08 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40154-8

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