Un novedoso análisis cuantitativo dirigido a X

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12856 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Los análisis de inactivación del cromosoma X (XCI) a menudo ayudan en el diagnóstico de rasgos ligados al cromosoma X; sin embargo, la evaluación precisa sigue siendo un desafío con los métodos actuales. Desarrollamos una estrategia novedosa utilizando enriquecimiento de Cas9 sin amplificación y secuenciación de tecnologías de nanoporos de Oxford llamada XCI-ONT, para investigar y cuantificar rigurosamente XCI en el gen del receptor de andrógenos (AR) humano y el gen de la retinitis pigmentosa 2 ligada al cromosoma X (RP2) humano. XCI-ONT mide la metilación de 116 CpG en AR y 58 CpG en RP2, y separa los cromosomas X parentales sin sesgo de PCR. Mostramos la utilidad de la estrategia XCI-ONT sobre la técnica XCI estándar de oro basada en PCR que solo investiga uno o dos CpG por gen. Los resultados resaltan las limitaciones de utilizar la técnica estándar de oro cuando el patrón XCI está parcialmente sesgado y las ventajas de XCI-ONT para cuantificar rigurosamente XCI. Este estudio proporciona un método XCI universal sobre el ADN, que es muy valioso en el marco clínico y de investigación de los rasgos ligados al cromosoma X.

La inactivación del cromosoma X (XCI) es un mecanismo de compensación de la diferencia en el número de cromosomas X entre hombres (46XY), mujeres (46XX) e individuos con aneuploidías X1. El mecanismo molecular del XCI humano no se comprende completamente2,3, pero los estudios han demostrado que el XCI está controlado por factores que actúan en cis y en trans en el centro de inactivación de X (Xic), incluida la expresión génica del transcrito específico inactivo de X (XIST). y genes de transcripción específica activa X (XACT)3. Esto eventualmente conduce a la expresión monoalélica y la acumulación de H3K27me33 y la metilación de sitios CpG cerca de los promotores de genes en el cromosoma X inactivo (Xi) (Fig. 1A)4,5,6. La metilación ha demostrado ser importante para el mantenimiento del estado inactivo de Xi7,8,9,10. La XCI en humanos se inicia en la etapa temprana de implantación embrionaria3, y la elección de qué cromosoma X se inactivará se describe en general como un proceso aleatorio, donde ambos cromosomas X están igualmente representados11,12. Sin embargo, se ha observado que la inactivación preferencial de un cromosoma X, el llamado XCI sesgado, modifica la manifestación de la enfermedad ligada al cromosoma X en mujeres portadoras, lo que indica que el genotipo es importante en la elección del cromosoma X activo (Xa), posiblemente por selección celular debido a una desventaja de célula mutante13,14,15,16. En primer lugar, el silenciamiento preferencial del alelo patógeno se ha asociado con una supervivencia femenina selectiva o un efecto menos grave de los rasgos ligados al cromosoma X. Se ha demostrado que el sesgo extremo es un buen indicador de la presencia de variantes patógenas ligadas al X en mujeres portadoras15,17,18 y, por lo tanto, los análisis XCI en parientes familiares a menudo ayudan en la interpretación de las variantes ligadas al X. En segundo lugar, la expresión del alelo patógeno puede conducir a la manifestación de fenotipos en mujeres portadoras de rasgos ligados al cromosoma X19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 y puede explicar las diferencias fenotípicas observadas en mujeres portadoras afectadas y individuos con aneuploidías X21,24,29,30,31,32,33,34,35,36. Es de destacar que se recomienda realizar análisis XCI en tejidos relevantes, a diferentes edades y en no fumadores37,38,39,40,41,42,43,44. En general, la definición de asimetría ha sido > 80:20, pero debido a las limitaciones de la técnica estándar de oro utilizada para el análisis XCI, no se ha recomendado la cuantificación de la asimetría para un silenciamiento que no sea 100:0, lo que destaca la necesidad de un método cuantitativo. .

(A) Esquema del mecanismo de inactivación del cromosoma X y su efecto en mujeres portadoras de rasgos ligados al cromosoma X. Azul: cromosoma X activo (Xa), rojo: cromosoma X inactivo (Xi), estrella amarilla: variante patógena ligada al cromosoma X. Ilustraciones creadas con Adobe Illustrator 2022 (disponibles en https://adobe.com/products/illustrator). (B) Los métodos XCI estándar de oro utilizan enzimas de restricción sensibles a la metilación (HpaII) que cortan el Xa pero dejan el Xi intacto. HpaII se dirige a dos y un sitio CpG en el receptor de andrógenos (AR) y Retinis pigmentosa 2 (RP2), respectivamente, y es seguido por PCR y análisis de longitud de fragmentos (FLA) que abarca regiones polimórficas repetitivas (CAGn o GAAAn) que separan los alelos parentales. Ilustraciones creadas con Adobe Illustrator 2022 (disponibles en https://adobe.com/products/illustrator). El enfoque XCI-ONT corta el ADN independientemente del estado de metilación mediante el enriquecimiento CRISPR-Cas9 con tres ARNg (rosa) que flanquean una región de interés (ROI) de ~ 3 kb que abarca 116 sitios CpG en AR y 58 sitios CpG en RP2. (C) XCI-ONT incluye: (1) Desfosforilación de los extremos 5' para reducir la ligadura de adaptadores de secuenciación a hebras fuera del objetivo. (2) El sistema CRISPR-Cas9 se une y corta el ROI, y el ADN tiene una cola dA para la ligadura del adaptador a los lados cortados de Cas9, que tienen colas dA 3' y fosforiladas 5'. (3) La biblioteca se secuencia utilizando Oxford Nanopore Technologies y llamada de base Bonito. (4) Llamar a las repeticiones alineando las lecturas con los genomas de referencia que contienen todas las repeticiones posibles en las regiones, y las lecturas se dividen en haplotipos trazando el número de lecturas con diferentes repeticiones. Por último, la cuantificación y la llamada de metilación se realizan con Nanopolish y los datos se visualizan con Integrative Genomics Viewer (IGV). Se calcula la metilación promedio del ROI y se determina la relación XCI entre los dos cromosomas X.

El análisis XCI estándar de oro utiliza enzimas de restricción sensibles a la metilación (MSRE), PCR y análisis de longitud de fragmentos (FLA) dirigidos a dos regiones del cromosoma X; el primer exón del gen del receptor de andrógenos (AR) humano45 y la región promotora del gen de la retinitis pigmentosa 2 (RP2) ligada al cromosoma X humano46. La metilación de los sitios CpG en estas regiones está asociada con XCI en humanos46,47,48 y mediante el uso de diferentes MSRE con varias secuencias diana, uno o algunos sitios CpG en estos genes a menudo se investigan utilizando el análisis estándar de oro. La metilación de CpG en AR y RP2 es de interés específico en los análisis XCI debido a su proximidad a elementos repetitivos polimórficos altamente conservados (CAGn en AR y GAAAn en RP2, tasa de heterocigosidad combinada de 0,97) que pueden usarse para separar los alelos parentales usando FLA ( Figura 1B). Sin embargo, el análisis estándar no es sólido ya que se basa en MSRE para la digestión, se basa en PCR y es semicuantitativo. Los resultados suelen ser difíciles de interpretar debido a los picos de tartamudeo de la PCR, las estructuras secundarias y/o los polimorfismos en el fragmento que afectan el tamaño del fragmento y, por lo tanto, sesgan la separación de los alelos. Además, la PCR y la FLA no son adecuadas para cuantificar la expresión desequilibrada de los dos cromosomas X, dejando a menudo a favor el fragmento más pequeño49.

La cuantificación es necesaria cuando el nivel de asimetría es < 100:0 y en la zona gris de la definición de asimetría (> 80:20), utilizada a menudo en la interpretación de variantes ligadas al cromosoma X. Además, la cuantificación puede ser muy útil cuando XCI modifica la enfermedad, por ejemplo, en la investigación de mujeres portadoras que presentan síntomas debido a la expresión del alelo patógeno (silenciamiento incompleto). Se han propuesto anteriormente enfoques para cuantificar los niveles de XCI en el alelo materno y paterno, pero esto requiere conversión con bisulfito y PCR50 o datos de secuenciación de ARN y ADN emparejados del gen XIST usando variantes heterocigotas de un solo nucleótido (SNV) transcritas informativas para separar los genes parentales. alelos41,51. Un SNV no es tan informativo como los elementos repetidos y, por lo tanto, no se puede utilizar para distinguir entre individuos. Esto destaca la necesidad de un análisis XCI cuantitativo universal del ADN que se utilizará en aplicaciones de investigación y diagnóstico clínico relacionados con rasgos ligados al cromosoma X.

La secuenciación con tecnologías de nanoporos de Oxford (ONT) se puede utilizar para detectar la metilación de CpG revelada por cambios en la señal eléctrica bruta durante el proceso de secuenciación. Las lecturas largas son poderosas para investigar la metilación en regiones repetitivas y secuencias ricas en GC, como las islas CpG. Además, una alta cobertura sin amplificación es una medida cuantitativa de metilación muy útil. Sin embargo, una alta profundidad de lectura de todo el genoma es costosa y, por lo tanto, un enfoque de enriquecimiento podría resultar ventajoso. Recientemente, se lanzó una preparación de biblioteca dirigida sin amplificación antes de la secuenciación de lectura larga utilizando el sistema CRISPR-Cas9 para secuenciar eficazmente regiones objetivo complicadas con alta cobertura y sin sesgo de PCR52,53,54,55,56. El análisis sin pasos de PCR es importante para evitar la pérdida alélica y permitir la medición cuantitativa de la metilación. Aquí, demostramos una estrategia novedosa para cuantificar XCI utilizando el enriquecimiento CRISPR-Cas9 de las regiones AR y RP2 junto con la secuenciación ONT para la detección de repetición y metilación. La nueva estrategia se denomina XCI-ONT en este artículo y se compara con el método XCI estándar de oro (Fig. 1B, C).

En este estudio, XCI se investigó por primera vez utilizando la estrategia estándar de oro basada en PCR de los genes AR y RP2. La familia investigada fue descrita previamente con discapacidad intelectual ligada al cromosoma X (OMIM #300966) causada por una variante TAF1 (c.3568C > T;p.(Arg1190Cys), NM_004606.4) donde las mujeres portadoras tenían un XCI sesgado ~ 100:0 cuando investigando el gen AR57. El resultado de XCI se confirmó en este estudio investigando el locus RP2 de dos mujeres portadoras asintomáticas (IV:8, III:10) y una mujer asintomática no portadora (III:7) (Figura complementaria 1). Las dos hembras portadoras asintomáticas presentaron un estado XCI sesgado de ~ 100:0 consistente con el cromosoma X materno en silencio (portador de la variante patógena). La mujer asintomática no portadora tenía expresión de ambos alelos, es decir, un estado XCI aleatorio; sin embargo, el método presenta resultados variables entre experimentos y resultados contrastantes en los diferentes genes (63:37 en AR vs. 47:53 en RP2). Además, se investigaron tres hembras (hembra I, II y III) utilizando el método del estándar de oro. Todos los individuos mostraron diferentes proporciones de XCI tanto para AR (mujer I 62:38, mujer II 47:53 y mujer III 81:19) como RP2 (mujer I 81:19, mujer II 60:40 y mujer III 87:13) (Tabla 1, Figura complementaria 2).

Para abordar las limitaciones de la técnica estándar de oro y cuantificar la proporción de cromosomas X maternos o paternos activos, desarrollamos XCI-ONT y lo aplicamos en las mismas muestras (Fig. 1B, C). XCI-ONT utiliza el protocolo de enriquecimiento de Cas953 con tres ARNg en ambos lados de una región de ~ 3 kb que abarca las mismas repeticiones y sitios CpG que el método estándar de oro de los genes AR y RP2 (Tabla complementaria 1). Los enriquecimientos de la región fueron seguidos por secuenciación de ADN y detección simultánea de metilación mediante secuenciación ONT. Esto permite la detección directa de repeticiones sin sesgo de PCR y la detección de metilación de 116 CpG en AR (chrX: 67543761–67546170, hg38) y 58 CpG en RP2 (chrX: 46836539–46837273, hg38), en comparación con la técnica estándar de oro que investiga sólo uno o dos CpG por gen45,46. La investigación XCI-ONT generó entre 43 y 155 lecturas en el objetivo, de las cuales 32 a 105 se usaron para calcular las frecuencias de metilación para separar los haplotipos (Tabla complementaria 2). Las repeticiones se detectaron mediante alineamiento con el genoma de referencia que contenía una variedad de longitudes de repeticiones naturales en cada gen, respectivamente. El número de repeticiones en el nuevo ensayo XCI-ONT en AR y RP2 fue consistente con las diferencias de pares de bases detectadas utilizando el ensayo estándar de oro (Figuras complementarias 1, 2 y 3). La llamada de metilación y el cálculo de la frecuencia de metilación se realizaron utilizando Nanopolish58. Se visualizó el estado de metilación y se calculó el estado de XCI utilizando la frecuencia de metilación promedio en dichas regiones y luego calculando la relación de la metilación promedio entre los alelos en cada gen. Las dos hembras portadoras asintomáticas (IV:8 y III:10) presentaron un estado XCI sesgado usando XCI-ONT con una proporción de metilación de 95:5 (IV:8) y 97:3 (III:10) en AR, y 91 :9 (IV:8) y 91:9 (III:10) en RP2. La mujer asintomática no portadora (III: 7) presentó un estado XCI aleatorio con una relación de metilación de 31:69 en AR y 34:66 en RP2 (Tabla 1, Fig. 2 y Tabla complementaria 3). Las mujeres I y II mostraron un estado XCI aleatorio, y la mujer III presentó un estado XCI aleatorio para AR pero un estado XCI sesgado para RP2. La hembra I fue analizada dos veces (hembra II y hembra I.II) con una nueva muestra de ADN para investigar la solidez del método. Las proporciones fueron las siguientes; 28:72 (mujer II), 27:73 (mujer I.II), 54:46 (mujer II), y 81:19 (mujer III) en AR y 26:74, (mujer II) 27:73 (mujer I.II), 67:33 (hembra II), y 92:8 (hembra III) en RP2. Los resultados de la hembra I fueron muy consistentes entre las dos series separadas (28:72 vs. 27:73), lo que demuestra la solidez y especificidad de XCI-ONT (Tabla 1, Figura 4 complementaria y Tabla 3 complementaria). Se investigó y visualizó la variabilidad de las llamadas de metilación entre los dos haplotipos en todas las lecturas y sitios CpG analizados. Se puede observar un patrón distinto para la mayoría de los sitios CpG entre haplotipos metilados y no metilados para IV:8 y III:10 tanto para AR como para RP2 (Figuras complementarias 5A-D). Para las mujeres I y II, los diferentes haplotipos no se pueden distinguir utilizando el estado de metilación (Figuras complementarias 5E-L). La hembra III no muestra distinción entre los haplotipos de AR, pero muestra una clara división entre los haplotipos de RP2 (Figura complementaria 5M, N).

Visualización del resultado de XCI-ONT utilizando Integrative Genomics Viewer (IGV) que presenta sitios CpG metilados (rojo; Xi) y sitios CpG no metilados (azul; Xa) en las lecturas de los genes del receptor de andrógenos (AR) y de Retinis pigmentosa 2 (RP2). Las mujeres portadoras asintomáticas (IV:8, III:10) presentan un patrón XCI sesgado y las mujeres asintomáticas no portadoras (III:7) de la misma familia tienen un estado XCI aleatorio. La barra superior en cada visualización de haplotipo indica la cobertura de lectura (altura) y el porcentaje de llamadas metiladas y no metiladas en cada posición.

Demostramos una combinación de enriquecimiento CRISPR-Cas9 y secuenciación ONT (XCI-ONT) como una estrategia novedosa y exitosa para cuantificar XCI en mujeres, que puede usarse para investigar rasgos ligados al cromosoma X. En este caso, se investigó XCI en una familia con discapacidad intelectual ligada al cromosoma X57, utilizando la estrategia estándar de oro basada en PCR de los genes AR y RP2, y luego se comparó con el resultado de XCI-ONT de los mismos genes. La investigación XCI estándar de oro de hembras portadoras (IV:8 y III:10) reveló un estado XCI sesgado ~ 100:0 en AR y RP2, lo que resultó en el silenciamiento del alelo patógeno como mecanismo protector contra la enfermedad. La investigación XCI estándar de oro de una hembra asintomática no portadora de la misma familia (III:7) así como de tres individuos adicionales (hembra I-III) expresaron ambos alelos (XCI aleatorio), sin embargo el método estándar de oro presentó resultados variables entre experimentos y contrastando resultados en los diferentes genes (63:37 en AR, 47:53 en RP2 para III:7 y 62:38 en AR, 81:19 en RP2 para hembra I). Los resultados resaltan las limitaciones de utilizar el método estándar de oro cuando el patrón XCI está sólo parcialmente sesgado45,46.

Para abordar esto y cuantificar la proporción de cromosomas X maternos o paternos activos, desarrollamos XCI-ONT y lo aplicamos en las mismas muestras que en el análisis estándar de oro. El método XCI-ONT detecta 116 CpG en el gen AR y 58 CpG en el gen RP2, en comparación con solo uno o dos CpG por gen utilizando el método estándar de oro45,46. Las dos hembras portadoras asintomáticas presentaron un estado XCI sesgado con 95:5 (IV:8) o 97:3 (III:10) en el gen AR, y 91:9 en el gen RP2 (IV:8 y III:10). , lo cual es consistente con los resultados del estándar de oro, afirmando el protocolo XCI-ONT establecido presentado en este documento. La mujer asintomática no portadora (III:7) y la mujer I presentaron un estado XCI aleatorio utilizando XCI-ONT con una relación de metilación de 31:69 y 28:72 en AR y 34:66 y 26:74 en RP2 respectivamente, lo que implica una detección claramente diferente y robusta usando XCI-ONT en comparación con la investigación estándar de oro que presentó resultados contrastantes entre genes y experimentos (63:37 y 62:38 en AR, 47:53 y 81:19 en RP2). Estos resultados muestran una detección XCI sólida de diferentes proporciones en ambos genes y confirman que se prefiere la investigación cuantitativa XCI-ONT cuando el patrón XCI está parcialmente sesgado. A pesar del pequeño tamaño de la muestra de este estudio, los resultados muestran una investigación XCI más precisa con un gran potencial cuantitativo utilizando la nueva estrategia XCI-ONT en comparación con el método estándar de oro semicuantitativo. También mostramos que volver a analizar a un individuo utilizando una nueva muestra de ADN produce el mismo resultado, lo que demuestra la solidez del método.

Para distinguir los alelos, tanto el estándar de oro como la estrategia XCI-ONT utilizan la ventaja de elementos repetitivos polimórficos altamente conservados en AR y RP2. Las repeticiones son útiles para separar cromosomas ya que los alelos parentales a menudo difieren en el número de unidades repetidas. La investigación estándar utiliza FLA para la detección indirecta de las repeticiones y separa los alelos por tamaño de fragmento. En consecuencia, la división del haplotipo puede verse sesgada por indeles y fluoróforos o estructuras secundarias que afectan la longitud del fragmento detectado. ONT tiene el poder de detección directa de repeticiones, lo que subraya el poder de usar XCI-ONT para la división de haplotipos. Esta conclusión fue respaldada porque la diferencia en la duración de las repeticiones entre los dos haplotipos fue consistente al comparar los dos métodos, excepto en la mujer I, donde el segundo haplotipo muestra 22 repeticiones con FLA y 39 repeticiones con XCI-ONT. Lo más probable es que esto se deba al hecho de que FLA es un método basado en PCR que no puede manejar una gran cantidad de repeticiones.

Para investigar la asimetría de XCI, tanto el estándar de oro como la estrategia XCI-ONT utilizan el nivel de metilación de los diferentes haplotipos en AR y RP2. Sin embargo, el método estándar de oro tiene limitaciones, ya que se basa en MSRE para la digestión y solo investiga la metilación de uno o unos pocos sitios CpG en la región. En comparación, la estrategia XCI-ONT investiga la metilación en 116 sitios CpG en AR y 58 sitios CpG en RP2 mediante secuenciación ONT. Para considerar la frecuencia del error de llamada de metilación, en este análisis solo se han incluido lecturas con llamadas de metilación constantes (consulte la sección "Métodos"). Por lo tanto, algunos sitios CpG pueden terminar sin estado de metilación (Figura 5 complementaria) y, por lo tanto, el estado XCI-ONT se informa como una proporción de la metilación promedio entre los cromosomas. Los estudios futuros que incluyan más muestras pueden revelar qué sitios son los más confiables para usar en el análisis y, por lo tanto, perfeccionar este método y mejorar aún más la precisión. En teoría, confirmado por los resultados de este estudio, XCI-ONT da como resultado una medición de XCI más precisa en comparación con los métodos estándar de oro, especialmente con hembras parcialmente sesgadas, lo que indica el poder de usar ONT y más de un sitio CpG en los análisis de XCI. Esto se confirma por la variabilidad de la metilación observada en los sitios CpG en los dos haplotipos de todos los individuos investigados (Figura complementaria 5).

En este estudio, se utilizaron tanto el gen AR como el RP2 para confirmar el estado de XCI. La proporción de metilación de los alelos puede diferir ligeramente en los genes debido a una mala división del haplotipo causada por ≤ 2 repeticiones en diferencia en RP2, más CpG en la región AR investigada o errores de llamada de metilación. XCI-ONT tiene el potencial de aumentar la cantidad de ARNg que se dirigen a genes ligados al cromosoma X adicionales, mejorando aún más la precisión. Además, hasta la fecha, una limitación en la llamada de metilación solo permite la detección de metilación dentro de ventanas de 10 pares de bases y, por lo tanto, XCI-ONT no se puede comparar con el método estándar de oro a nivel de sitio CpG. Sin embargo, aunque esto todavía no es una posibilidad con Nanopolish, esta investigación está en constante evolución y se espera que sea posible pronto.

Paralelamente a nuestro estudio, la secuenciación de ONT demostró ser una herramienta prometedora para investigar XCI en el cromosoma X6, pero, hasta donde sabemos, la secuenciación de ONT como un enfoque específico para separar los haplotipos y cuantificar XCI no se ha informado antes. Además, el rendimiento de la secuenciación ONT en comparación con los métodos XCI estándar de oro no se ha demostrado antes.

En resumen, demostramos por primera vez XCI-ONT como una nueva estrategia exitosa para cuantificar XCI en mujeres portadoras de rasgos ligados al cromosoma X. Esto es útil en el trabajo clínico y la investigación cuando el paciente se encuentra en la zona gris de la definición sesgada (> 80:20), lo que a menudo ayuda en la interpretación de variantes ligadas al cromosoma X. Además, la cuantificación puede resultar muy útil en la investigación de mujeres portadoras que manifiestan síntomas debido a la expresión del alelo patógeno. La cuantificación de XCI puede iluminar el mecanismo de la enfermedad y proporcionar información útil para mejorar la evaluación del riesgo prenatal36, el diagnóstico y el desarrollo del tratamiento de los rasgos ligados al cromosoma X. Por último, nos gustaría iluminar la posibilidad de que diferentes trastornos y variantes patogénicas requieran diferentes niveles de expresión para desarrollar síntomas y enfatizar el uso de una investigación cuantitativa XCI para responder estas preguntas. Una aplicación relacionada para XCI-ONT es monitorear la reactivación farmacológica de Xi, que se ha sugerido como tratamiento para los trastornos ligados al cromosoma X debido a XCI sesgado59,60,61,62.

Se recibió la aprobación ética del comité de ética local de la Autoridad Sueca de Revisión Ética para la investigación en humanos en Uppsala, Suecia (Dnr 2012/321). Las muestras se reclutaron en el Departamento de Genética Clínica del Hospital Universitario de Uppsala y se recibió el consentimiento informado de todos los participantes. El estudio se realizó según las directrices de la Declaración de Helsinki. El ADN genómico de HMW se extrajo de 200 µl de sangre de seis hembras usando el kit Nanobind CBB Big DNA (Circulomics) de acuerdo con los procedimientos estándar o usando el método de sal (protocolo estándar disponible a pedido) seguido de una limpieza con el kit Nanobind CBB Big DNA. (Circulomica). La familia investigada en este estudio fue descrita previamente con discapacidad intelectual ligada al cromosoma X (OMIM #300966) causada por una variante c.3568C > T;p.(Arg1190Cys) en el gen TAF1 (NM_004606.4)57. En el análisis actual se incluyó ADN de dos hembras portadoras (III:10, IV:8) y una hembra no portadora (III:7), así como de tres hembras no relacionadas (hembra I-III).

Se cortaron doscientos ng de ADN genómico utilizando HpaII FastDigest sensible a la metilación en un volumen total de 20 µl siguiendo las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific). La PCR que abarca el gen AR se realizó utilizando un kit de PCR de largo alcance (Qiagen) con entrada de 50 ng de ADN o 2 µl de ADN digerido con cebadores y condiciones de ciclado descritas anteriormente45. El gen RP2 se amplificó en una reacción de 20 µl que contenía tampón de reacción de PCR 1X, dNTP 250 nM, 1 uM de cada cebador, 1 U de polimerasa Taq, 50 ng de ADN o 2 µl de ADN digerido con cebadores y condiciones de ciclador térmico descritas anteriormente46. El genotipado se realizó utilizando FLA en el analizador genético ABI 3130xl con estándar de tamaño ROX500 (Thermo Fisher Scientific). El polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) se determinó utilizando Geneious Prime versión 2022.01 con el complemento de microsatélite (https://www.geneious.com). Las alturas de los picos se midieron utilizando el software ImageJ63 seguido del cálculo de la relación de altura. Se utilizó ADN de una muestra femenina con un patrón XCI conocido (100:0) como control durante todo el proceso de análisis.

Se diseñaron tres ARN CRISPR (ARNcr) en ambos lados de cada región de interés en los genes AR y RP2 utilizando CHOPCHOP64 y se seleccionaron de acuerdo con las instrucciones descritas anteriormente (versión del protocolo de enriquecimiento sin PCR mediado por Cas: ENR_9084_v109_revD_04Dec2018). Todos los ARNcr Alt-R diseñados a medida (Integrated DNA Technologies, Tabla complementaria 2) se agruparon como una mezcla equimolar de ARNcr (100 µM) y se ensamblaron con ARNcr transactivadores (tracrRNA) (Integrated DNA Technologies, cat 1073190) utilizando tampón dúplex ( Integrated DNA Technologies, cat 11010301) según las instrucciones del fabricante. El enriquecimiento de Cas9 se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando 4 a 5 μg de ADN y tampón de fragmento largo (protocolo de enriquecimiento sin PCR mediado por Cas SQK-CS9109). Las muestras se procesaron en una celda de flujo MinION R9.4.1 y se operaron utilizando el software MinKNOW (versión 20.10.3).

La llamada de base se realizó utilizando Bonito basecaller (versión 0.3.8) y las lecturas se alinearon con el genoma de referencia humano (GRCh38/hg38) usando minimap2 (versión 2.18-r1015). Solo se consideraron para análisis posteriores las lecturas dirigidas a las regiones de interés en AR (chrX:67543761–67546170, hg38) y el gen RP2 (chrX:46836539–46837273, hg38). Para permitir la repetición de llamadas, se creó una base de datos interna con genomas de referencia que contienen de 5 a 40 repeticiones CAG (gen AR) y de 5 a 30 repeticiones GAAA (gen RP2). El rango de números de repetición utilizados en la alineación se ha descrito previamente en la población general no afectada (entre 9 y 38 en AR y entre 10 y 20 en RP2)46,65. Las llamadas repetidas se realizaron mediante alineación con la base de datos interna utilizando minimap2 (versión 2.18-r1015) y el número de repeticiones en las lecturas se identificó utilizando Integrative Genomics Viewer (versión 2.10.0, calidad base> 20). Los datos se visualizaron trazando el número de lecturas (eje y) que contienen cualquier repetición en el rango de 5 a 40 repeticiones en AR o 5 a 30 repeticiones en RP2 (eje x) (Figura complementaria 3). Las lecturas se dividieron en haplotipos según el recuento de repeticiones y la comparación con los resultados del estándar de oro. La llamada de metilación y el cálculo de la frecuencia de metilación se realizaron utilizando el paquete de software Nanopolish (versión 0.12.0). En el análisis de metilación solo se incluyeron sitios con una relación de probabilidad logarítmica > 2,5 (metilada) o < − 2,5 (no metilada) (Figura complementaria 5). Los archivos Bam se convirtieron utilizando el paquete "conversión de bam para igv"66 y el estado de metilación se visualizó utilizando el CG en modo bisulfito de Integrative Genomics Viewer (versión 2.10.0). El estado de XCI se estableció utilizando la frecuencia de metilación promedio en la región chrX:67543761–67546170 (gen AR, 116 sitios CpG, hg38) y chrX:46836539–46837273 (gen RP2, 58 sitios CpG, hg38) seguido del cálculo de la relación de la metilación promedio entre los alelos de cada gen.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA), [Accesión del estudio: PRJEB53974, ERP138789]”.

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Deseamos agradecer a la familia por participar en este estudio. Gracias a Mai-Britt Mosbech y sus colegas del Centro del Genoma de Uppsala, Infraestructura Nacional de Genómica/SciLifeLab, Universidad de Uppsala por su valioso apoyo técnico en el procedimiento de extracción de ADN. Gracias al equipo de analistas de Klinisk genetik, hospital universitario de Uppsala, por sus aportaciones sobre el análisis FLA.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Uppsala. Este estudio fue financiado por subvenciones de la Fundación Magnus Bergvalls, la Sociedad Sueca de Medicina, la Fundación Nilsson-Ehle, la Sociedad Sueca de Investigación Médica (SSMF), la Fundación Åke Wiberg, la Fundación Jeansson, Svenska læker sälläket (SLS) y la Fundación Tore Nilsson. JJ y SG recibieron subvenciones de la fundación Sävstaholm. SL, ML, MW y JJ recibieron subvenciones del "Acuerdo entre el Estado sueco y determinados consejos provinciales sobre cooperación en materia de formación básica de médicos, investigación médica y desarrollo de la asistencia sanitaria" (ALF). SG contó con el apoyo de la fundación Knut y Alice Wallenberg.

Departamento de Inmunología, Genética y Patología, Laboratorio Science for Life, Universidad de Uppsala, Husargatan 3, Box 815, SE-751 08, Uppsala, Suecia

Josefin Johansson, Sarah Lideus, Ida Höijer, Adam Ameur, Göran Annerén, Marie-Louise Bondeson y Maria Wilbe

Programa en Genética Médica y Poblacional, Broad Institute of MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE.UU.

Sanna Gudmundsson

División de Genética y Genómica, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, EE. UU.

Sanna Gudmundsson

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JJ, M.-LB y MW concibieron el estudio. JJ, MW, M.-LB y AA contribuyeron con el diseño experimental y analítico. M.-LB y GA contribuyeron con material de pacientes. JJ, SL, IH y SG realizaron los experimentos. JJ, SL, ME y MW realizaron el análisis. JJ ilustró y preparó las figuras. JJ y MW redactaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a María Wilbe.

JJ, MW y ML.B: Solicitud de patente pendiente “CUANTIFICACIÓN DE LA INACTIVACIÓN DEL CROMOSOMA X” (Número de solicitud 2250254-6). SL, GA, SG, AA, ME, IH: No hay intereses en competencia.

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Johansson, J., Lidéus, S., Höijer, I. et al. Un nuevo análisis cuantitativo dirigido a la inactivación del cromosoma X (XCI) mediante secuenciación de nanoporos. Representante científico 13, 12856 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34413-3

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Recibido: 12 de abril de 2022

Aceptado: 29 de abril de 2023

Publicado: 08 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34413-3

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